什么是耐药结核病？
结核病是一种经呼吸道传播的慢性传染病，在全球广泛流行。如果病人感染的结核分枝杆菌对一种或一种以上的抗结核药物产生了耐药性，即为耐药结核病。根据耐药类型和严重程度不同，耐药结核可分为利福平耐药、耐多药结核病、准广泛耐药结核病、及广泛耐药结核病等，耐药结核病可能由传染所致，也可能自发形成。
为什么耐药结核病防治如此严峻？
结核病已成为威胁全球公共卫生的首要传染病。据WHO统计，我国在30个结核病高负担国家中位列第3位1。耐药结核病是可防、可治的，但如不尽早确诊甚至误诊，则可能会发展为耐多药结核或广泛耐药结核，增加传播风险。耐药结核已成为“终结结核病战略”的最大阻碍。为什么结核病的耐药这么复杂棘手？
简单来说，结核分枝杆菌（Mocybactrium Tubercolosis，MTB）的结构和功能与其他细菌相比更为独特和复杂，如果能解读结核分枝杆菌的表型耐药与其基因组突变之间的关系，就能够实现对耐药相关变异的精准检测，从而进行耐药预测2。这对耐药结核的防治和抗结核药物的开发都大有裨益，而基因测序技术是检测结核耐药相关变异强有力的工具。
什么是“终结结核病战略”？
世界卫生组织(World Health Organization, WHO)最早在2015年提出了“终结结核病战略”3，旨在推进全球合作共同完成2035年全面消灭结核病的目标。2021年，WHO首次发布《结核分枝杆菌耐药相关基因突变目录》，并在2023年更新发布第二版，第二版目录收集了来自 40 多个国家38,000 多个临床分离株的全基因组数据、以及与之相匹配的对15种抗结核药物的表型药物敏感结果的分析结果4。这可以看作是一份宝贵的“大辞典”，用来指导全球的研究者开发分子药物敏感性检测工具5。值得一提的是，WHO分别在2018年和2021年发布的结核分枝杆菌耐药监测指南中，均推荐了基因测序技术作为结核监测、和耐药突变检测的工具6，7。
图1. WHO发布指导结核相关文件
什么是靶向测序技术？
靶向测序技术（Targeted Next-Generation Sequencing, tNGS）是一种基于高通量基因测序技术，针对特定基因或基因区域进行深度测序从而实现目标序列捕获的技术。靶向测序技术目前主要分为基于引物PCR扩增的扩增子测序和基于探针杂交的杂交捕获测序两种方法。靶向测序技术的特别之处正是“靶向”二字，它针对性地对研究人员感兴趣的特定基因、或基因组片段进行富集，例如科学家可以选择与某种疾病发病高度关联的一个基因片段进行富集，而后再进行常规建库测序和分析，从而获得高质量的有效遗传信息。WHO在2023年发布的Use of targeted next-generation sequencing to detect drug-resistant tuberculosis：Rapid communication 和最新在今年3月20日更新的WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 3: Diagnosis - Rapid diagnostics for tuberculosis detection, third edition 中纷纷强调了靶向测序技术在耐药结核变异检测中的价值和应用潜力8，9。华大智造ATOPlex多重PCR建库试剂盒定制平台，搭配DNBSEQ测序平台，可实现高质量的靶向测序。ATOPlex多重PCR建库试剂盒定制平台以自主研发的超高重PCR核心技术为基础，为客户提供性能优异的定制化panel和建库试剂，完美兼容华大智造测序仪和自动化平台，有助于将靶向测序应用于包括耐药结核防治在内的精准医疗、药品研发、食品安全、农业等多个领域。
图2. ATOPlex多重PCR靶向建库技术原理
靶向测序技术如何助力耐药结核防治？
关键词：成本可及
相较于全基因组测序技术，靶向测序技术只需针对性地富集感兴趣的区域，在提高测序通量的同时，也能大大降低数据储存成本。虽然，高通量测序技术与传统的分子检测方法相比，依然是一种成本和门槛较高的技术，但WHO在快速通告中指出，利用靶向测序技术用于多耐药基因和变异、多病原体检测时，临床成本效益将大幅提高8。
关键词：灵敏
关键词：灵敏
由于靶向测序技术会针对目标基因片段进行富集操作，因此它提供更高的检测灵敏性，无需培养，可直接从临床各类型的体液样本中进行提取检测，大大节约了时间成本。
关键词：灵活和可扩展
关键词：灵活和可扩展
目前，推荐用于结核病治疗的抗结核一线和二线药物超过15种，WHO发布的变异目录中所列举的与这些药物的敏感性相关的变异覆盖基因超过24个，且随着收集数据的不断扩大和完善，这个数字还将持续增加！这就不得不提靶向测序技术的另一个优势：灵活和可扩展。靶向测序技术可以实现根据目标区域设计、调整和补充引物，实现一次性覆盖所有感兴趣的区域，这是传统的分子检测手段所不能望其项背的。我国是耐药结核发病大国，我国公共卫生防控工作者在遏制耐药结核的播散和传播的防控道路上砥砺前行，致力于抗结核药物的分子流行病学、结核分枝杆菌遗传多样性方面的研究。靶向测序技术高效、灵敏、全面的优势能够帮助快速建立我国结核分枝杆菌耐药突变目录，为耐药结核防治提供强大的工具支撑。华大智造秉承“创新智造引领生命科技”的理念，致力于为公共卫生防控持续提供更有力的工具。继去年8月推出“结核分枝杆菌全基因组测序组合产品”后，华大智造基于ATOPlex技术，已开展研发ATOPlex MTB靶向建库试剂和测序的相关产品，即将上市，敬请期待！
参考文献
1. World Health Organization. Global tuberculosis report 2023.Geneva: World Health Organization, 2023.
2. Walker TM, Whole-genome sequencing for prediction of Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility and resistance: a retrospective cohort study. Lancet Infect Dis. 2015 Oct;15(10):1193-1202.
3. World Health Organization, The end TB strategy, Geneva: World Health Organization, 2015.
4. World Health Organization, Catalogue of mutations in Mycobacterium tuberculosis complex and their association with drug resistance, 2nd ed, Geneva: World Health Organization, 2023.
5. 裴少君，欧喜超，世界卫生组织《结核分枝杆菌耐药相关基因突变目录（第2版）》解读，中国防痨杂志 2024年3月第46卷第3期
6. World Health Organization, Technical manual for drug susceptibility testing of medicines used in the treatment of tuberculosis. Geneva: World Health Organization, 2018.
7. World Health Organization, Guidance for the surveillance of drug resistance in tuberculosis, sixth edition, Geneva: World Health Organization, 2021.
8. World Health Organization. Use of targeted next-generation sequencing to detect drug-resistant tuberculosis: rapid communication, July 2023. Geneva: World Health Organization,2023.
9. World Health Organization. WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 3: Diagnosis - Rapid diagnostics for tuberculosis detection, third edition, March 2023. Geneva: World Health Organization,2024.